La différenciation de l’origine vaccinale ou sauvage des Poliovirus au laboratoire est une étape importante vers le processus d’éradication de la poliomyélite. Dans cet article, nous rapportons les résultats obtenus sur des souches de Poliovirus type 3 et 2, isolés à Madagascar en 1997 et 2002 à partir d’enfants asymptomatiques et de cas de paralysie flasque aiguë, respectivement. La technique utilisée est basée sur l’amplification du génome (RT-PCR), suivie de l’analyse du Polymorphisme de la Longueur des Fragments de Restriction enzymatique (RFLP), dans 3 régions différentes du génome. Dans la région capsidale (VP3- VP1 et VP1-2A), l’analyse RFLP a permis de différencier sans ambiguïté l’origine sauvage ou vaccinale des souches de Poliovirus type 3, et d’identifier des Virus Dérivés de Souches Vaccinales (VDSV) de type 2. Dans la région non capsidale incluant l’ARN polymérase et la région 3’ non codante (3Dpol-3’NC), les VDSV se sont avérés être en plus des virus recombinants avec d’autres Entérovirus. Ces résultats confirment que la technique RFLP est un outil fiable de différenciation intratypique et d’étude de la dérive génétique et des phénomènes de recombinaison des Poliovirus.