Contexte et justification
Bloquer la transmission des parasites constitue unedes nouvelles stratégies de lutte contre le paludisme.. Afin de mettre en évidence l’effet d’un produit ou d’un traitement sur la transmission des plasmodies vers l’anophèle ou étudier la compétence vectorielle de certaines espèces d’anophèles, l’Institut Pasteur de Madagascar a entrepris de développer ses compétences dans le domaine de l’infection expérimentale. La production de gamétocytes en laboratoire est une étape cruciale.
Objectifs
Mettre en place la production de gamétocytes de P. falciparum nécessaires à la réalisation de l’infection expérimentale des anophèles
Méthodes
La souche P. falciparum 3D7 communément utilisée dans différents centres de recherche et l’isolat malgache P. falciparum 2012-532 adapté en culture sont utilisés pour la mise en place de la production de gamétocytes. Ils sont maintenus en culture dans le milieu de culture RPMI 1640 + albumax jusqu’à ce que la parasitémie dépasse les 5%. Après synchronisation au sorbitol 5%, les parasites sont remis en culture en utilisant le milieu de culture RPMI 1640 + sérum humain avec un hématocrite à 2%. La gamétocytogénèse est induite par le faible apport d’hématies, l’utilisation de sérum humain et l’apport d’hypoxanthine. Pendant 3 jours, un tiers du milieu de culture est renouvelé. Dès l’apparition de gamétocytes de stade II et III, le milieu de culture est supplémenté de pyriméthamine à 60 nM (PYR) et de N-Acétylglucosamine à 50 mM (NAG) pour éliminer les formes asexuées des parasites. A partir de J4, on utilise pour l’entretien quotidien des cultures le milieu RPMI 1640 + sérum humain + albumax. L’examen microscopique est fait tous les jours pour détecter et dénombrer les gamétocytes matures de stade V.
Résultats et discussion
Après l’induction, les gamétocytes de stade I apparaissent à J2, se transforment en stade II à partir de J4 et en stade III en J6. La transformation de stade IV en stade V se fait à partir de J7 avec un pic à J9 (Figure 1). A J10, le nombre de gamétocytes stade V de P. falciparum 3D7 est 5 fois plus élevé après induction par NAG + PYR avec une nette prédominance de gamétocytes femelles par rapport à l’induction par NAG seulement. Pour l’isolat P. falciparum 2012-532, la production spontanée de gamétocytes est conservée. A J9, le nombre de gamétocytes stade V est 1,3 fois plus élevé après induction par NAG + PYR avec des quantités comparables de gamétocytes mâles et femelles par rapport à l’induction par NAG seulement.
Figure 1 : Gamétocytes de P. falciparum 3D7
Compte tenu de ces résultats, nous utilisons l’induction de la gamétocytogenèse par NAG + PYR.
Quatre séries de production de gamétocytes sont effectuées après la mise au point de la méthode. Après les examens microscopiques des frottis minces sur 50 champs, la quantité de gamétocytes produits suffit pour réaliser l’infection expérimentale des anophèles (Figure 2).
Figure 2 : Gamétocytes stade V de P. falciparum 3D7 et P. falciparum 2012-532 à J10
Impact
La mise en place de la production de gamétocytes de P. falciparum étant réalisée, l est dorénavant possible d’effectuer l’infection expérimentale pour évaluer entre autres l’impact des antipaludiques sur la transmission de Plasmodium en utilisant des anophèles élevés à l’IPM.
