Contexte et justification
Etudier l’histoire évolutive et le mécanisme de dispersion des puces vectrices de la peste est essentiel pour inférer leur origine et leur histoire d’introduction, mais surtout pour comprendre si le mode de dispersion de l’insecte est associé à la propagation de la maladie. L’étude phylogéographique de la puce X. cheopis à l’échelle nationale ou à l’échelle mondiale n’a jamais été faite alors que cette espèce est d’importance médicale, surtout à Madagascar où la peste est une maladie endémique. La détermination et le choix des marqueurs à utiliser sont essentiels car ils permettront d’obtenir les données génétiques (nucléotidiques) qui seront analysées et interprétées.
Objectifs
Les objectifs sont de :
- Identifier des marqueurs permettant de révéler le polymorphisme chez cheopis
- Déterminer les lignées phylogénétiques et leur distribution géographique
- Méthodes
Les marqueurs mis au point par PCR sont : les marqueurs mitochondriaux LCO1490/HCO2198 (Folmer et al. 1994), LCO1490puc_t1/LCO1490Hem1_t1/HCO2198puc_t1/HCO2198Hem2_t1/HCO2198Hem1_t1 (Cœur d’Acier, pers. comm.), COII-F-Leu/COII-R-Lys et le marqueur nucléaire 28S A/28S rD7b1 (Whiting 2002). Les mises au point ont été effectuées en faisant varier les températures d’hybridation des amorces (Tm). L’extraction d’ADN total, les PCR et le séquençage ont été effectués. Les données de séquences obtenues ont servi à faire des analyses préliminaires.
Résultats et discussion
Cent quatre-vingt-neuf spécimens appartenant à 12 populations ont été utilisés. Les conditions optimales d’amplification des marqueurs figurent dans le tableau 1. Pour l’instant, le séquençage a pu être effectué en utilisant le marqueur COI (Cœur d’Acier) avec 151 séquences obtenues. Dix-neuf haplotypes (I-XIX) ont été identifiés (analyses en cours). L’haplotype II regroupe 128/151 individus en provenance de 11/12 populations. C’est l’haplotype majeur avec une fréquence de 0,85. La présence de ces différents haplotypes suggère qu’il y a une diversité génétique interpopulation à Madagascar. Les autres haplotypes restant possèdent des fréquences faibles de 0,01 à 0,03 et dont chacun se trouve dans un site particulier. L’étape suivante sera de séquencer en utilisant prioritairement le marqueur 28S (marqueur nucléaire). La comparaison des marqueurs permettra d’avoir une idée de la diversité intraspécifique à Madagascar en utilisant plusieurs marqueurs.
Tableau 1 : Conditions optimales d’amplification des marqueurs
| Marqueurs | Tm optimales, durée hybridation (nombre de cycles) |
| COI (Folmer et al., 1994) | 56-58°C, 1mn (30 cycles) |
| COI (Cœur d’Acier, pers. comm.) | 45°C, 40s (5 cycles) puis 51°C, 40s (35 cycles) |
| COII (Whiting, 2002) | 62°C, 1mn (30 cycles) |
| 28S (Whiting, 2002) | 59°C, 1mn (30 cycles) |
Impact
Cette étude préliminaire contribue à l’étude plus approfondie estimant le mode de dispersion des puces vectrices de la peste (et donc la propagation de la maladie) à Madagascar.